來源：韓研活性炭網 作者：韓研活性炭網 2017-12-20
活性炭分離蛋白質,根據活性炭的大小和有效電荷的不同，應用活性炭來分離蛋白質。為了有效地分離蛋白質與活性炭，建議了三條準則。(1)活性炭可用于從較大的蛋白質中有效去除較小的蛋白質雜質。(2)在接近雜質等電點的溶液pH下，最有效地去除較小的蛋白質雜質，其中它們具有最小的有效電荷。(3)最有效的從活性炭回收小蛋白質的過程發生在離蛋白質等電點更遠的溶液pH，在那里強電荷。測量各個聚合物和蛋白質的結合能力的研究被用于開發這三個指導方針，然后將它們應用于幾種不同蛋白質混合物的分離。活性炭分離蛋白質的能力被證明是廣泛適用于三種不同類型的活性炭通過靜態處理和流過活性炭填充柱。
活性炭是一種具有高表面積的多孔材料，通過非共價相互作用物理吸附分子。常用于水凈化和食品飲料行業，用于非選擇性去除較低濃度的蛋白質。另外，活性炭用于從蛋白質溶液中去除小分子，并且通常使用葡聚糖涂層來防止蛋白質與活性炭表面之間的接觸。然而，盡管涉及蛋白質的活性炭有很多應用，但是對影響這些相互作用的因素的理解有限。
我們最近發現某些等級的活性炭可用于選擇性地從含有單克隆抗體的進料流中去除宿主細胞蛋白(HCP)雜質。我們感興趣的是，這種相對便宜的吸附材料可用于分離蛋白質，并深入研究了解為什么活性炭選擇性地吸附HCP而不是單克隆抗體。因此，我們研究了不同條件下幾種模型聚合物和蛋白質與活性炭的吸附，以確定控制其相互作用的關鍵因素。根據我們對活性炭的吸附研究，我們提出了三種有效分離蛋白質的指導方針，并能夠證明其在分離幾種不同蛋白質混合物中的應用。
蛋白質大小是影響蛋白質與活性炭分離的第一個因素。對活性炭的早期研究證實，在含水條件下小分子的結合強度隨著同系列中單元數量的增加而增加。這種關系符合Traube的表面張力規律，可以很好地解釋甲酸，乙酸，丙酸，丁酸等一系列小分子吸附強度的增加然而，盡管大分子如聚合物和蛋白質具有很強的結合強度，但其容量受限于其不能進入中孔(2-50nm)和微孔(<50nm)內所含活性炭表面積的顯著部分2納米)。從活性炭內表面的部分排除大分子應該允許它從較大的蛋白質中選擇性地去除較小的蛋白質，如果孔的尺寸足夠的話。蛋白質有效電荷對其與活性炭相互作用的影響也將受到其表面上的官能團的影響。在這項研究中調查的活性炭的類型來自用磷酸化學活化的木材。先前已經報道過，這些類型的活性炭具有主要由芳族基團和含氧官能團組成的表面，其取決于活化過程在濃度和類型上變化。在含水條件下，蛋白質應該能夠通過疏水性相互作用與活性炭表面上的芳香族結構結合，但是這種相互作用也受到表面上任何帶電基團的影響。檢測活性炭和蛋白質之間相互作用的一種方法是測量容量作為溶液pH的函數。例如，如果溶液的pH低于蛋白質的等電點，那么它將具有總體正電荷，因此應當更容易被帶負電的表面吸收。文獻中有報道指出蛋白質上的電荷確實影響活性炭的蛋白結合能力。
用活性炭分離低分子量蛋白質
雖然活性炭的大小選擇性使其成為純化較高分子量蛋白質的理想選擇，但是我們好奇它是否也可用于純化較低分子量的蛋白質。如果較低分子量的蛋白質產物和蛋白質雜質具有顯著不同的等電點，這可能是可能的。然后可以在接近蛋白質雜質的等電點的溶液pH下進行選擇性純化，并進一步遠離蛋白質產物的等電點。在此pH下，靜電排斥會降低活性炭對更強電荷蛋白質產物的結合能力，并最大化其對弱電荷蛋白質雜質的結合能力。c和1.0mg / mL的α-乳清蛋白，在靜態結合條件下用活性炭在4.0-9.0的pH下進行。通過分析反相HPLC測定用活性炭處理后保留在溶液中的細胞色素c和α-乳清蛋白的百分比，并將其作為溶液pH的函數作圖(圖1)。
圖1. 在靜態結合條件下用活性炭處理1：1溶液后剩余的細胞色素c和α-乳清蛋白的百分比作為溶液pH的函數繪制。
現用活性炭處理1：1溶液后剩余的細胞色素c和α-乳白蛋白的百分比隨溶液pH而變化很大。在pH4.0和5.0時，在等電點4.8附近除去最大量的α-乳白蛋白。(28)相比之下，最大量的細胞色素c在pH9.0被除去，最接近蛋白質的等電點10.5。(27)在6.0或7.0的中等pH下，活性炭除去了相似量的兩種蛋白質。
用活性炭流通分離蛋白質
在之前的實驗中證明，在靜態結合條件下，活性炭可用于分離蛋白質。然而，通過流過填充的活性炭柱來處理蛋白質溶液會更方便。流過吸附介質是有利的，因為它減少了處理時間，并且消除了靜態處理后除去介質所需的固/液分離步驟。在該實驗中，將由代表蛋白質雜質的0.5mg / mL的細胞色素c和代表pH 4.0或9.0的產物的5.0mg / mL的α-乳清蛋白組成的溶液流過填充有活性炭的色譜柱。細胞色素c的濃度通過分析型反相HPLC測定柱級分中的α-乳白蛋白，并作為α-乳白蛋白的質量加載量除以活性炭的體積的函數繪圖(圖2)。
圖2. 在pH4.0或pH9.0的0.5mg / mL的細胞色素c和5.0mg / mL的α-乳清蛋白溶液通過色譜柱后，收集12.5mL級分中的細胞色素c和α-乳清蛋白的濃度活性炭。
活性炭填充柱的流通實驗結果與靜態結合研究結果非常吻合，這些研究顯示出對溶液pH的強烈依賴性。在pH 4.0時，細胞色素c雜質在第一部分中突破。相反，在pH9.0時，直到第七部分(其中柱裝載有1.09g的α-乳白蛋白/ mL活性炭)未觀察到細胞色素c雜質的穿透。測量的α-乳白蛋白的總體回收率在pH 4.0時僅為88%，而在pH 9.0時回收率為94%。溶液通過pH4.0的活性炭柱后，細胞色素c的濃度雜質從100 000增加到106 125 ppm，導致只有-0.03 LRV。相比之下，在pH 9.0時，細胞色素c雜質的濃度從100 000顯著降低至10 584ppm，導致0.98LRV。
已經證明，蛋白質的大小和有效電荷強烈地影響其在活性炭上的吸附。用不同分子量的葡聚糖和磺化聚苯乙烯進行的結合研究證實活性炭對較大分子具有較低的結合能力。這表明較大的蛋白質不能夠獲得較小孔中所包含的活性炭內表面積的顯著百分比。當溶液pH值接近蛋白質的等電點時，發現活性炭具有最大的結合能力，其中蛋白質上有最小的有效電荷。這種理解被應用于純化更高分子量的單克隆抗體，其中發現在最接近雜質等電點的溶液pH下最有效地去除了較低分子量的蛋白質雜質。
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